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DIA定量蛋白组

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> 技术简介

  DIA是最近几年新发展的一种质谱数据采集方式,是目前最热门的蛋白质组技术,该技术被Nature Methods杂志评为2015年最值得关注的技术。对于临床研究中数量庞大的、复杂的、个体差异大的样本,DIA提供条件统一、无差别的质谱采集方法,对样本进行高通量、高速度采集,所得数据再进行深入解析和挖掘,是临床蛋白质组学研究的利器。

> 技术原理

  将整个质谱扫描质量范围分为若干窗口,超高分辨质谱快速对每个窗口中的所有离子进行选择、碎裂、检测,从而无遗漏、无差异地获得样本中所有离子的全部碎片信息,不会造成低丰度离子信息的丢失,数据利用度大大提高,缺失值更少。DIA数据中包含了所有碎片离子的保留时间和强度信息,可实现对大量样本中所有可检测的蛋白谱峰信息进行完整采集和高重复性分析。

 

> 技术优势

  高准确性:基于二级离子定量,准确性高

  高重现性:缺失值少,CV值低

  高灵活性:蛋白数据库可重复利用

  高通量:可同时非标定量几千个蛋白

> 应用领域

  疾病标志物筛选、疾病机制研究、药物作用靶点研究、用药及预后研究、植物抗逆研究、营养吸收机制研究、发育机制研究、稀有物种研究、特殊功能蛋白质筛选。

> 技术路线

> 实验仪器

  Q Exactive HF-X (Thermo Fisher)

  Orbitrap Fusion™ Lumos™ Tribrid™(Thermo Fisher)

  Orbitrap Exploris™ 480(Thermo Fisher)

Orbitrap Exploris™ 240(Thermo Fisher)

  Orbitrap Fusion™ Tribrid™ (Thermo Fisher)

> 数据分析

  数据质控结果;蛋白谱图库构建结果;蛋白定性定量结果;蛋白差异分析;火山图(Volcano);表达丰度箱式图;平行样本相关性分析;主成分分析(PCA);层次聚类分析(Heatmap);表达模式聚类分析;数据交叠分析(Venn);差异蛋白GO功能注释及富集分析;差异蛋白Pathway功能注释及富集分析;蛋白互作网络构建

 

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> 研究案例

血浆蛋白组定量分析

Eslam N. Nigjeh, et al. J. Proteome Res.2017, 16(2):665-676

> 研究背景

  血浆是临床疾病诊断,预后和检测治疗反应的重要信息来源。本研究采用DIA方法进行临床血浆样本的蛋白质组定量,首先建立了胰腺癌血浆蛋白数据库并对DIA质谱采集参数设置进行优化。在临床样本分析之前,本研究首先检验了生物样本重复性及质谱技术重复性,并对定量的线性动态范围及定量下限进行评估。

> 研究路线

> 研究结果

1.血浆蛋白数据库

 

  本研究将正常人、慢性胰腺炎患者和可切除胰腺癌患者的血浆去除高丰度蛋白后的混合样,进行阴离子交换柱分离,所得的10个组分用于DDA建库。通过高分辨率Orbitrap Fusion质谱仪,一共在血浆中鉴定到14320个特异性多肽和2317个蛋白,超过50%以上的蛋白有2个以上特异性多肽,蛋白丰度范围超过10个数量级。

 

 

2.DIA方法评估

 

  本研究使用了4个生物学样本进行生物学重复性评估,且每个样本做3次质谱技术重复。分析结果显示生物学重复及技术重复性均理想,其中生物学变化大于技术重复。

 

> 质量控制

  样本平行性质控

  左右分别代表归一化前、后的各样本蛋白定量强度分布。纵轴为Log10蛋白定量强度,样本对应箱形图的中位数越一致,表明各样品实验操作一致性越高。归一化后(右图)的中位数应该处于一个水平线。

 

 

  CV值区间统计

  对#组样本,经过#次技术重复鉴定到的 precursors的总鉴定数、CV(变异系数)<20%和 CV<10%的鉴定数,分别如下图所示 。CV值为衡量指标中各观测值变异程度的一个统计量,同组内CV越小,组内样本的差异越小。QC样本为混样,可以用于衡量仪器和实验操作引入的偏差。

 

> 数据可视化

  QC样本的相关性分析

  所有数据可视化分析均由Perseus软件作图,首先对normalized intensity进行log2转换——样本分组。相关性分析主要针对有做生物学重复的实验数据,用来评估平行样本间个体差异的大小。采用pearson相关系数来衡量其相关性,R2越接近于1,图中的点越靠近表示重复性越好。横坐标和纵坐标分别为该组实验样品蛋白相对定量值的Log2对数值,任意两组重复实验的R2如图上标注所示。

 

 

  PCA分析

  PCA分析通过对数据进行降维分析,从而检测实验组间的差异性及组内的重复性。PCA二维图中,空间分布差异越小,表示两个样本的数据越接近。图中每个点代表一个实验样本,并以不同颜色区分不同实验分组。差异显著的实验,同一组内的不同样本应该聚集在一个相对集中的范围内,并可以与其他组的数据聚集区域区分开。

 

 

  火山图

  通过火山图(Volcano Plot)可以快速地查看蛋白在两组样品中表达水平的差异,以及差异的统计学显著性。

 

 

  差异蛋白层次聚类分析

  聚类分析是模式识别和数据挖掘中普遍使用的一种方法,是基于数据的知识发现的有效方法,表达模式相似的蛋白通常具有相似的功能。对定量到的蛋白进行聚类(纵向),并根据蛋白表达量对样本进行聚类(横向),颜色对应蛋白质表达量。

  基于样本中筛选出的差异蛋白(Multi Sample Test ANOVA p-value≤0.05)进行层次聚类,对Normalized Intensity值在横向和纵向上分别计算z-socre。

 

 

  差异蛋白cluster聚类

  基于层次聚类的结果,对各聚类中的蛋白在不同样本中的表达量进行cluster聚类分析,直观的反应出处理条件与蛋白表达水平的关系。横坐标为处理条件,纵坐标为蛋白表达强度,颜色代表该蛋白与整体表达趋势的偏离程度,暖色(红)表示接近整体表达趋势,冷色(绿)表示偏离整体表达趋势。

 

> 功能分析

  差异蛋白GO分类分析

  OmicsBox软件含有Blast2GO功能注释模块,可以对差异蛋白进行功能注释分析,该模块是一个综合性的生物信息学工具,用于对基因或蛋白质序列进行进行注释,获取与这些蛋白质所有相关的功能信息,包括Gene Ontology(GO)和通路等注释信息。由于背景注释库的局限性,因此不是所有的蛋白都能获得相应的注释信息。目前注释信息比较全的物种为模式物种,即:人、大鼠、小鼠、拟南芥、水稻、斑马鱼、线虫、大肠杆菌、酵母菌等。有些非模式物种的蛋白注释信息不全,需要通过与模式物种或接近的注释信息较多的近源物种的蛋白blast,为所研究的差异蛋白进行功能注释。

  GO总共有三个本体,分别描述基因的分子功能(MF)、所处的亚细胞位置(CC)、参与的生物过程(BP)。GO定义的术语有有向无环式(directed acyclic graphs, DAGs)的特点,随着Level(代数)增加,下一级比上一级更为具体。例如,己糖合成途径为第3级,那么,它的上一级为己糖代谢和单糖合成。

 

 

  差异蛋白GO富集分析

  GO 功能富集分析给出与蛋白质组背景相比,在差异表达蛋白中显著富集的GO功能条目,从而给出差异表达蛋白与哪些生物学功能显著相关。该分析首先把所有差异表达基因向Gene Ontology数据库(http://www.geneontology.org/)的各个term映射,计算每个term的蛋白数目,然后找出与整个蛋白质组背景相比,在差异表达蛋白中显著富集的条目。差异蛋白GO富集分析,由于考虑到了统计算法,结果比GO分类更为严格。

  对筛选出的差异表达蛋白利用Blast2GO软件进行GO富集分析,对富集到的前10个GO功能条目(按照-LOG10 p-value从大到小排序)。

 

 

  差异蛋白KEGG信号通路分类分析

  在生物体内,不同蛋白相互协调行使其生物学行为,基于Pathway的分析有助于更进一步了解其参与的通路。KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)是有关Pathway的主要公共数据库。计算差异蛋白在不同Pathway 的分布情况,可以对差异蛋白进行归类,寻找不同样品的差异蛋白可能和哪些细胞通路的改变有关。

 

 

  差异蛋白Pathway富集分析

  根据筛选出的差异蛋白,计算差异蛋白同Pathway的超几何分布关系,根据p-value判断差异蛋白是否在相应Pathway中出现富集。通过差异蛋白的Pathway分析,可以找到差异蛋白显著富集的Pathway条目,寻找不同样品的差异蛋白可能和哪些细胞通路的改变有关,富集分析结果比分类结果更为严格。 

  对富集到的KEGG通路前20个(按照p-value由小到大的顺序)作气泡图,图中KEGG富集程度通过Rich factor、p-value和富集到此通路上的蛋白个数来衡量。其中Rich factor指该Pathway中富集到的差异蛋白个数与注释蛋白个数的比值。Rich factor越大,表示富集的程度越大。p-value越接近于零,表示差异表达蛋白在该通路中的富集显著性越可靠。

  纵轴表示Pathway名称,横轴表示Rich factor(该Pathway中富集到的差异蛋白个数与注释蛋白个数的比值)。富集因子越大,表示差异表达蛋白在该通路中的富集水平越显著。图中每一个圆点表示一个KEGG通路,圆点的大小代表富集到该通路的蛋白的数目,圆点的颜色代表p-value,p-value越小表示差异表达蛋白在该通路中的富集显著性越可靠。

   

 

        为了便于查看差异蛋白在通路图中的分布情况,将差异蛋白标注到通路图中,显示显著富集的通路图。

  相对于对照组来说,红色框标记的为差异蛋白的节点,绿色框标记的为该物种特有的基因或酶。框内的数字代表酶的编号(EC number),整个通路由多种酶催化的复杂生化反应构成。此通路图中与差异表达蛋白相关的酶节点均用红色标出,根据研究对象间的差异,重点研究某些代谢通路相关蛋白的差异表达情况,通过通路解释表型差异的根源。

 

 

  蛋白质相互作用网络分析

        蛋白质相互作用网络分析通过两种方法实现:第一种,IPA软件基于自身数据库分析所得蛋白的相互作用关系,获得相互作用网络图;第二种,基于STRING、IntAct、Ihop、BioGRID、MINT、DIP等蛋白互作网络数据库获得蛋白的相互作用关系,Cytoscape软件对差异蛋白质进行相互作用网络构图。IPA软件只可以对哺乳动物进行分析,其余动植物或菌类需要第二种方法分析。

  图中的节点(node)为蛋白质,边为互作关系。互作网络中边(edge)的颜色表示此边连接的两个节点间的互相作用的关系形式,不相连的蛋白节点间没有已知的互作关系。

 

 

样本类型

送样量

动物样本

常规动物组织
(脑、心、肝、脾、肺、肾、肌肉和皮肤等;软体动物如血吸虫)

≥100 mg

坚硬动物组织(软骨、硬骨和牙组织等)

≥500 mg

植物样本

常规植物组织
(草本植物,木本植物的叶和花,藻类植物,蕨类植物等)

≥800 mg

坚硬植物组织(植物的根茎及果实种子等)

≥10 g

花粉

≥200 mg

微生物样本

≥300 mg

细胞样本

≥2×107

血清、血浆样本

≥500 μL

体液

尿液

≥50 mL

唾液

≥2 mL

羊水

≥5 mL

脑脊液

≥1 mL

关节液

≥1 mL

泪液

≥400 μL

蛋白质量/样

100 μg

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