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非靶代谢组
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非靶代谢组

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> 技术简介

  代谢组学是继基因组学和蛋白质组学之后新发展起来的一门学科,与基因组学和蛋白质组学的整体思路类似,是针对分子量<1000 Da的内源性小分子进行高通量定性、定量分析,寻找代谢物与生理病理变化的相对关系的一门学科。与靶向代谢组学相比,非靶向代谢组学的特点在于对所有小分子代谢物进行精准、高通量的测定,因此得到的代谢物信息更客观全面,从而避免研究的方向性错误。

> 技术原理

  液相色谱-质谱联用技术(LC-MS)逐渐被广泛地用于代谢组学的研究中。色谱-质谱联用技术可以将色谱的分离能力与质谱的定性功能结合起来,实现对复杂化合物更准确的定性和定量能力。基于色谱-质谱联用技术的代谢组学方法,流动相组成的微小变化,梯度的重现性及柱温的微小变化及柱表面的状态变化常导致保留时间的差异。为了利用色谱图中所有可以识别的峰信息,需对谱图实行峰匹配(或称峰对齐),使相同的代谢产物在生成的数据矩阵中由同一个变量表示,使各样本的数据得到正确比较。

 

 

> 技术优势

  高覆盖度:无偏向检测所有代谢物,可高达上千种

  高重现性: 基于UPLC系统,CV值低

  高通量:可高速检测样品,样品数量无上限。

> 应用领域

  疾病标志物筛选、疾病机制研究、药物作用靶点研究、用药及预后研究、植物抗逆研究、营养吸收机制研究、发育机制研究、稀有物种研究。

> 技术路线

  

> 实验仪器

  UPLC- Xevo G2-XS QTOF (Waters)

  UPLC- TripleTOF 6600+ (AB SCIEX)

  Orbitrap Exploris 240 (Thermo Fisher)

> 数据分析

  数据质控结果

  差异代谢物定性、定量结果

  PCA、OPLS-DA、PLS-DA

  Venn图

  相关性和聚类分析

  pathway分析

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> 研究案例

非靶向代谢组案例——慢性肾病代谢组学研究

Hua C, et al. J. Redox Biology, 2016, 10:168-178.

> 研究背景

  本实验通过马兜铃酸I诱导大鼠患上马兜铃肾病,构建模拟人类慢性肾病发病过程的动物模型。基于UPLC-MS代谢组学方法,对诱导4、8、12周的大鼠血浆进行检测,从中发现对药物敏感的代谢物,并通过诱导24周的大鼠和患有慢性肾病的病人血浆进一步验证差异代谢物,从而筛选慢性肾病发病的潜在生物标志物。

> 研究路线

> 研究结果

  本文通过临床生化检测和组织染色、Western实验确定模型构建成功。四个处理的时间点可以模拟疾病的发生。取马兜铃酸I处理4、8、12周的大鼠和control组各8只,通过UPLC-MS的方法检测血浆代谢物,PCA验证发现代谢物变化随时间有规律地变化,并找到19个三组共有的差异代谢物。

 

 

  通过限定AUC值和fold change大小,筛选到6个潜在的预测疾病的生物标志物——肌酸酐、胆酸、硫酸吲哚酚、牛磺鹅去氧胆酸、溶血磷脂酰乙醇胺(22:5)和溶血磷脂酰乙醇胺(20:2),其中4个只在诱导12个月的大鼠中存在。

 

  将潜在的6个靶点用马兜铃酸I诱导24小时的大鼠血浆和慢性肾病患者的血浆进行测试,ROC图的AUC数值显示具有很高的可靠性。

 

数据质控分析

  BPC Overlay

  在仪器进行数据采集的过程中,我们将插在样品中间的QC样品做overlay,确定保留时间和峰强度基本保持不变。纵轴表示峰强度,横轴表示出峰时间,左上角标明样品名称,每个颜色的线条表示一个样本的出峰情况,overlay越好,表明一致性越好。

   

 

 

  QC样本在PCA分析中的表现

  样本PCA分析,主要是对数据进行降维分析,可以检测实验组间的差异性及组内的重复性1。PCA分析计算有关代谢物组成的主成分,在二维图中,我们取前两个主成分PC1,PC2来表示样本,空间分布差异越小,表示两个样本的数据越接近。图中每个点代表一个实验样本,并以不同颜色区分不同分组。当仪器稳定时,QC样本相对集中在一起,不存在随时间变动的情况。

 

 

 

  QC样本的相关性分析

  为考察研究样本多次生物学实验的重复性,基于组间实验共定量代谢物的强度值进行相关性分析,横坐标和纵坐标分别为该组实验样品代谢物强度值取log2,任意两组重复实验共定量代谢物强度值的pearson相关系数如图所示。相关系数均大于0.80,表示QC一致性较好。

   

 

 

  样本重复相关性评估

  样本重复性可通过组内样本相关性表示。通常,组内样本的person相关性系数越大,表明获得的差异代谢物结果越可靠。相关系数越接近1,表明两样本重复性越强。

   

 

 

基础数据分析

  PCA分析

  PCA主要是对数据进行降维分析,可以检测实验组间的差异性及组内的重复性。在二维图中,取前两个主成分PC1,PC2来表示样本,空间分布差异越小,表示两个样本的数据越接近。图中每个点代表一个实验样本,并以不同颜色区分不同分组。重复性较好的实验,同一组内的不同样本应该聚集在一个相对集中的范围内,并可以与其他组的数据聚集区域区分开。

 

   

 

 

  OPLS-DA

  为了消除与分类不相关的噪音信息,同时也为了筛选导致分类差异的可信代谢物,选取正交偏最小二乘判别分析(orthogonal partial least-squares discrimination analysis,OPLS-DA)3过滤与分类不相关的信号,即正交信号,获得OPLS-DA模型,对模型的质量用交叉验证法进行检验(即用一部分样本数据制作分组模型,另外一部分数据用来测试已分组的模型),得到的R2Y和Q2分别代表模型可解释的变量和可预测度,可对模型的优劣进行判别。通过模型分析可以对代谢物进行VIP打分筛选,VIP分数越高的代谢物,对分组的贡献越大。

   

 

 

  S-plot图

  S-plot图的横坐标表示主成份与代谢物的协相关系数,纵坐标表示主成份与代谢物的相关系数。S-plot图一般用来挑选与OSC过程中主要成分相关性较强的代谢物,也可以挑选与Y相关性强的代谢物。通常,越靠近两个角的代谢物重要性越强,越值得被关注。

   

 

 

  OPLS-DA置换检验

  Permutation Test是对模型进行200次的随机验证。该图横坐标表示与模型的相似度,纵坐标为R2Y与Q2,R2在Y轴的截距小于0.4,Q2在Y轴的截距小于0.05,可认为模型没有出现过拟合,但有时候由于样本量较少,认为两条拟合线的斜率大于0即可。

   

   

 

个性化数据分析

  差异代谢物venn图

  利用venn图可以清晰明了的看出各组差异分析中的代谢物检出情况,中间部分的代谢物表示在每组差异比较组中均检测到。图中每一个颜色代表一组差异分析,数字表示该组差异分析中检出的差异代谢物,中间部分为所有分组中的共有差异代谢物

 

   

 

 

  差异代谢物云图

  云图可直观显示差异代谢物的整体分布情况,图中每一个点代表一个代谢物,横坐标表示每个代谢物的保留时间(Retention Time, RT),纵坐标表示质核比(m/z),显著上调的代谢物用红色点表示,显著下调的代谢物用绿点表示,p值大小由颜色深浅表示,圆圈的半径表示差异变化倍数。

 

 

 

  差异代谢物层次聚类分析

  聚类分析是模式识别和数据挖掘中普遍使用的一种方法,是基于数据的知识发现的有效方法4。在纵轴方向,对代谢物进行聚类,用颜色的深浅表示代谢物丰度的高低,横轴为样本信息。基于样本中筛选出的差异代谢物,根据类别进行绘图。

   

 

 

  差异代谢物相关性热图分析

  对VIP值前50的差异代谢物进行person相关分析,红色表示正相关,蓝色表示负相关。

 

   

 

 

代谢通路分析

  KEGG富集气泡图

  将统计分析获取的每组正负离子模式下的差异代谢物并集的compound name输入MBROLE 2.0软件中,将差异代谢物与数据库比对,获得差异代谢物参与的通路富集结果。将数据通过气泡图形式表示,如下图,每个气泡代表一个pathway。横坐标值越大,表示该通路中差异代谢物富集程度越高。点的颜色代表超几何检验的p-value值,值越小,说明检验的可靠性越大、越具有统计学意义。点的大小代表相应通路中差异代谢物的数目,越大,该通路内差异代谢物就越多。

   

 

 

  KEGG富集通路图

  在KEGG通路图中,圆圈代表代谢物,其中红色圆圈为注释到的差异代谢物。

   

 

 

  差异代谢物分类

  根据KEGG pathway数据库(https://www.kegg.jp/kegg/pathway.html)对注释到的代谢通路进行分类,结果如下:

   

 

样本类型

送样量

动物样本(心脏、肝脏、肾脏、肺部等)

≥100 mg

植物样本

常规植物组织
(草本植物,木本植物的叶和花,藻类植物,蕨类植物等)

≥200 mg

坚硬植物组织(植物的根茎及果实种子等)

≥500 g

花粉

≥200 mg

血清、血浆

≥100 μL

尿液

≥100 μL

粪便/肠道内容物

≥100 mg

细胞

≥1×107

微生物

≥2×108

培养液

微生物培养液

≥10 mL

细菌培养液

≥500 μL

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