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甲基化修饰

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> 技术简介

       蛋白甲基化(Methylation)通常发生在精氨酸和赖氨酸上,其发生过程是将甲基化通过甲基酶促转移到蛋白质的氨基酸残基上,可同时连接最多3个甲基基团。甲基化与癌症、衰老、老年痴呆等许多疾病密切相关。

>技术原理

       利用LC-MS对肽段的m/z进行精确检测,发生单/双/三甲基化的肽段分子量分别会增加14.02 Da/28.03 Da/42.05 Da。质谱可精确测定这些分子量的变化,从而检测甲基化修饰肽段及位点。

>技术优势

       全面性

高覆盖度

应用高分辨率、高精度质谱仪检测

>技术路线

 

 

> 应用领域

       疾病标志物筛选、疾病机制研究、疾病分型、个性化治疗、感染与免疫研究、药物作用靶点研究、用药及预后研究、基因表达调控研究、信号转导研究、特殊蛋白功能研究。

>实验仪器

       Q-Exactive HF-X(Thermo Fisher

Orbitrap Fusion™ Lumos™ Tribrid™(Thermo Fisher)

Orbitrap Exploris™ 480(Thermo Fisher)

Orbitrap Exploris™ 240(Thermo Fisher)

Orbitrap Fusion™ Tribrid™(Thermo Fisher)

>数据分析

       数据质控结果;甲基化位点鉴定结果;甲基化蛋白定量结果;差异分析;火山图(Volcano);表达丰度箱式图;平行样本相关性分析;主成分分析(PCA);层次聚类分析(Heatmap);表达模式聚类分析;数据交叠分析(Venn);差异蛋白GO功能注释及富集分析;差异蛋白Pathway功能注释及富集分析;蛋白互作网络构建;Motif 分析

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> 研究案例

        Carlson SM, et al. Nat Protoc. 2014, 9(1):37-50.

> 研究背景

       通过向赖氨酸侧链的ε-nitrogen添加甲基(最多三个)可以修饰多种非组蛋白。磷酸化、乙酰化和泛素化等翻译后修饰 (PTM) 可以通过抗体或化学亲和法进行富集。然而,这些方法对于赖氨酸甲基化并不适用。

> 研究路线

>研究结果

      研究将培养中的细胞与含轻/重稳定同位素标记的氨基酸一起生长。通过将细胞裂解物与3xMBT或阴性对照D355N突变体一起孵育,从而富集甲基化蛋白质。随后使利用LC-MS/MS来鉴定通过3xMBT pull-down富集的蛋白质。添加第三个同位素标记可以比较不同生物条件之间的蛋白质赖氨酸甲基化。与大多数方法不同,该策略不需要预先假设候选甲基化蛋白质,且与抗体富集方法相比,它识别的甲基化蛋白质范围更广。

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