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泛素化修饰

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> 技术简介

泛素化(Ubiquitination)是蛋白质翻译后修饰的一种,指的是蛋白质被一个或多个泛素(ubiquitin)共价修饰的过程,在几乎所有的真核细胞活动中起着关键作用。泛素化修饰由三种酶介导发生,分别是泛素激活酶(E1)、泛素结合酶(E2)和泛素连接酶(E3)。泛素(Ubiquitin)是一类在真核细胞中普遍存在的由76个氨基酸组成的高度保守小分子。泛素-蛋白酶体系统是细胞内绝大多数蛋白质降解的主要方式之一,研究蛋白质泛素化有助于了解DNA修复、免疫应答、细胞周期调控、增殖与分化、凋亡及蛋白质周转代谢的机制。

> 技术原理

对样本进行蛋白提取、酶切后,含泛素化的赖氨酸基团上会保留二甘氨酸标签,利用抗体进行泛素化特异性富集。蛋白发生泛素化修饰后,分子量会产生114.1 Da的质量偏移,质谱可以通过检测发生的质量偏差,从而检测泛素化修饰肽段及位点。

 

> 技术优势

高特异性:利用CTS抗体,富集效率高

全面性:以整个细胞所有蛋白为研究对象,研究细胞内所有具有生命功能的蛋白

>技术路线

 

 

> 实验仪器

Q-Exactive HF-X (Thermo Fisher)

Orbitrap Fusion™ Lumos™ Tribrid™(Thermo Fisher)

Orbitrap Exploris™ 480(Thermo Fisher)

Orbitrap Exploris™ 240(Thermo Fisher)

Orbitrap Fusion™ Tribrid™ (Thermo Fisher)

> 信数据分析

数据质控结果;泛素化位点鉴定结果;泛素化蛋白定量结果;差异泛素化位点;差异泛素化蛋白; 火山图(Volcano);表达丰度箱式图;平行样本相关性分析;主成分分析(PCA);层次聚类分析(Heatmap);表达模式聚类分析;数据交叠分析(Venn);差异蛋白GO功能注释及富集分析;差异蛋白Pathway功能注释及富集分析;蛋白互作网络构建;Motif 分析

> 应用领域

疾病标志物筛选、疾病机制研究、植物发育与抗逆、衰老再生及退行性疾病研究、细胞调节活动、药效评价。

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> 研究案例

       泛素化蛋白组发现抗衰老新机制
       Nature. 2021, 596(7871):285-290.

> 研究背景

       蛋白质是组成人体一切细胞、组织的重要成分,真核细胞内有数万种蛋白质行使着各自的功能,内源性蛋白质都有一定的寿命,行使完功能后就会被降解。泛素化(Ub)便是引导蛋白质降解的途径之一,对蛋白进行泛素化修饰,使其被细胞内相应的酶识别并降解,该过程是可逆的,能够被去泛素化酶(DUBs)逆转。尽管泛素化调控着几乎一切的生命活动,但是目前仍不清楚该过程对衰老的影响。

>研究思路

>研究结果

       研究发现,衰老导致泛素化的普遍丧失,主要原因是蛋白质中去除泛素的酶在衰老期间变得更加活跃。研究者对蛋白酶体靶标进行分析,发现了两种在衰老过程中缺乏泛素标记的蛋白:IFB-2:一种对细胞结构很重要的蛋白;EPS-8:一种调节多种细胞过程的信号通路的调节因子,这两种蛋白质在衰老的生物体中不再被充分标记,影响了各种组织的寿命,并利用基因改造模型明确了其参与的生物学功能。本研究发现了两个抗衰老的潜在靶标,为后续抗衰药物的研发提供了理论基础。

 

 

样本类型

送样量

动物样本

常规动物组织
(脑、心、肝、脾、肺、肾、肌肉和皮肤等;软体动物如血吸虫)

≥2 g

坚硬动物组织(软骨、硬骨和牙组织等)

≥10 g

植物样本

常规植物组织
(草本植物,木本植物的叶和花,藻类植物,蕨类植物等)

≥10 g

坚硬植物组织(植物的根茎及果实种子等)

≥20 g

花粉

≥10 g

微生物样本

≥1 mL

细胞样本

≥1×108

血清、血浆样本

≥1.5 mL

体液

尿液

≥50 mL

唾液

≥50 mL

羊水

≥50 mL

脑脊液

/

关节液

≥50 mL

泪液

/

蛋白质量/样

10 mg

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